एलएनपी आधारित जीन थेरेपी दवाओं का एलसीएमएस प्रीक्लिनिकल बायोएनालिसिस

आनुवांशिक बीमारियाँ अभी भी एक वैश्विक चुनौती हैं, क्योंकि वे जीन में उत्परिवर्तन के कारण होती हैं जो व्यक्तियों के जैविक कार्यों, चयापचय प्रक्रियाओं या कुछ आवश्यक प्रोटीनों के उत्पादन से लेकर विभिन्न वंशानुगत विकारों तक को प्रभावित करती हैं। जीन थेरेपी दवाएं एक प्रकार का चिकित्सीय हस्तक्षेप है जो विशिष्ट जीन को लक्षित करती है, जिसका लक्ष्य उनकी मरम्मत करना या संशोधित करना है, और कोशिकाओं को कार्यात्मक प्रोटीन का उत्पादन करने या बीमारियों का कारण बनने वाले जीन दोषों में हस्तक्षेप करने के लिए नए निर्देश प्रदान करना है।

सामान्य जीन दवाओं में मुख्य रूप से डीएनए और आरएनए शामिल हैं, जहां डीएनए चिकित्सीय प्रभाव वाले जीन टुकड़े या जीन अनुक्रम हो सकते हैं। ये डीएनए दोषपूर्ण या गायब जीन कार्यों को बदलने या पूरक करने के लिए कोशिकाओं तक पहुंचाया जाता है। आरएनए मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए), छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए), या एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एएसओ) आदि हो सकते हैं, जिनका उपयोग संशोधित करने, हानिकारक जीन की अभिव्यक्ति को रोकने या विशिष्ट जीन के कार्य को बहाल करने के लिए किया जा सकता है।

हालाँकि, डीएनए और आरएनए दोनों को मानव शरीर में प्रवेश करने से लेकर लक्ष्य कोशिकाओं तक पहुंचने तक कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। चूंकि जीन अनुक्रम जठरांत्र संबंधी मार्ग में अस्थिर होते हैं, इसलिए उन्हें आमतौर पर अंतःशिरा या चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाता है, लेकिन फिर भी, अधिकांश जीन अनुक्रम अभी भी मानव शरीर में प्रचुर मात्रा में न्यूक्लियस द्वारा अपमानित होते हैं।

जब थोड़ी मात्रा में अवशिष्ट जीन औषधियाँ लक्ष्य कोशिकाओं के बाहर पहुँचती हैं, तो वे कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर पाती हैं क्योंकि जीन अनुक्रम फॉस्फेट समूहों वाले बड़े अणु होते हैं जिनमें नकारात्मक आवेश होते हैं, जबकि कोशिका झिल्ली भी नकारात्मक आवेश ले जाती है। जब दो नकारात्मक आवेश मिलते हैं, तो जीन विकर्षित हो जाते हैं और कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर पाते हैं। इसलिए, हमें विवो में उनके क्षरण को रोकने और कोशिका झिल्ली प्रवेश की दक्षता में सुधार करने और कोशिकाओं तक डीएनए या आरएनए अनुक्रमों को सुचारू रूप से पहुंचाने के लिए विशिष्ट जीन दवा वितरण विधियों को विकसित करने की आवश्यकता है।

जीन औषधियों के लिए वितरण विधियाँ

वर्तमान सामान्य जीन वितरण विधियों को मुख्य रूप से दो श्रेणियों में विभाजित किया गया है: वायरल वेक्टर डिलीवरी और गैर-वायरल वेक्टर डिलीवरी। वायरल वेक्टर डिलीवरी में मुख्य रूप से एडेनो{2}}एसोसिएटेड वायरस (एएवी) और लेंटिवायरस आदि शामिल हैं, जो मेजबान कोशिकाओं के वायरस संक्रमण की प्रक्रिया का अनुकरण कर सकते हैं और सेल बाधाओं को आसानी से पार कर सकते हैं, इस प्रकार उच्च डिलीवरी दक्षता प्राप्त कर सकते हैं। हालाँकि, वायरल वेक्टर डिलीवरी में समस्याएँ भी हैं: सबसे पहले, इसकी पैकेजिंग क्षमता सीमित है, जैसे कि AAV की अधिकतम पैकेजिंग क्षमता 4.7kb है, जो लंबे जीन अनुक्रम वितरित नहीं कर सकती है; दूसरे, वायरल वैक्टर सेलुलर प्रतिरक्षा और ह्यूमरल प्रतिरक्षा सहित गंभीर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकते हैं, जो नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों के लिए जोखिम पैदा करते हैं। इसकी तुलना में, गैर-वायरल वैक्टर में सुरक्षा और दवा लोडिंग क्षमता में भारी फायदे हैं।

वर्तमान में आम तौर पर उपयोग किए जाने वाले गैर-{0}}वायरल वैक्टर में मुख्य रूप से लिपोसोम, पॉलिमर, नैनोकण, एक्सोसोम आदि शामिल हैं, जिनमें से लिपोसोम 100nm से 1um तक के व्यास वाले एम्फीफिलिक अणुओं द्वारा निर्मित पुटिकाएं हैं। वे मुख्य रूप से फॉस्फोलिपिड्स, कोलेस्ट्रॉल, पीईजी लिपिड और धनायनित लिपिड से बने होते हैं। फॉस्फोलिपिड बाइलेयर संरचना कोशिका झिल्ली के समान है और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं में आसानी से प्रवेश कर सकती है। इसके अलावा, लिपोसोम विशिष्ट ऊतकों या कोशिकाओं को लक्षित करते समय शरीर की प्रतिरक्षा निकासी से बचने के लिए अपनी सतहों पर पीईजी या विशिष्ट एंटीबॉडी को भी संशोधित कर सकते हैं। धनायनित लिपोसोम ऐसे लिपोसोम होते हैं जिनमें सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए चतुर्धातुक अमोनियम नमक लिपिड होते हैं, जो नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए न्यूक्लिक एसिड दवाओं के साथ बेहतर तरीके से बंध सकते हैं और वितरण प्रणाली की स्थिरता को बनाए रख सकते हैं। इसलिए, जीन दवाओं के लिए लिपोसोम सामान्य गैर-वायरल वेक्टर वितरण विधियों में से एक है।

हालाँकि, पारंपरिक लिपोसोम में कुछ समस्याएं भी हैं: सबसे पहले, लिपोसोम व्यास के बड़े विस्तार के कारण, हालांकि यह पर्याप्त दवा लोडिंग क्षमता सुनिश्चित कर सकता है, जब लिपोसोम संवहनी एंडोथेलियल गैप (100 - 200nm) से गुजरते हैं, तो बहुत बड़ा आकार इस प्रक्रिया में बाधा उत्पन्न करेगा। इसके अलावा, लिपोसोम एंडोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करने और एंडोसोम-लाइसोसोम प्रणाली बनाने के बाद, पारंपरिक लिपोसोम समय पर लाइसोसोमल पलायन को पूरा नहीं कर पाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश जीन दवाएं लाइसोसोम द्वारा नष्ट हो जाती हैं और अपना प्रभाव डालने में असमर्थ हो जाती हैं। जीन दवाओं को वितरित करने में पारंपरिक लिपोसोम की इन कमियों के आधार पर, लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) को विकसित किया गया है और यह एक महत्वपूर्ण वितरण विधि बन गई है जो विशेष रूप से लक्ष्य कोशिकाओं और ऊतकों तक न्यूक्लिक एसिड पहुंचाने के लिए उपयुक्त है।

एलएनपी कैरियर सिस्टम का परिचय

लिपिड नैनोकण (एलएनपी) नैनोकण हैं जो लिपिड जैसे पदार्थों से बने होते हैं और इनका व्यास आमतौर पर 10-200nm के बीच होता है। पारंपरिक लिपोसोम की तुलना में, वे छोटे होते हैं और संवहनी एंडोथेलियल अंतराल से गुजरना आसान होता है। इसके अलावा, एलएनपी में आमतौर पर धनायनित/आयोनिजेबल लिपिड, सहायक फॉस्फोलिपिड, पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल (पीईजी) लिपिड और कोलेस्ट्रॉल होते हैं। उनमें से, सहायक फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल एलएनपी की स्थिरता को बढ़ा सकते हैं; पीईजी लिपिड विवो में एलएनपी के परिसंचरण समय को बढ़ाने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कम करने में मदद करते हैं। इन घटकों में पारंपरिक लिपोसोम के समान कार्य होते हैं। अंतर धनायनित/आयनीकरणीय लिपिड में निहित है, जो एलएनपी के लिए पेटेंट संरक्षण का मुख्य क्षेत्र भी है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, धनायनित लिपोसोम न्यूक्लिक एसिड दवाओं के साथ बंधन को प्रभावी ढंग से बनाए रख सकते हैं और न्यूक्लिक एसिड दवाओं की वितरण दक्षता में सुधार कर सकते हैं। हालाँकि, धनायनित लिपोसोम भी शरीर के परिसंचरण में नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए प्लाज्मा प्रोटीन, रक्त कोशिकाओं आदि के साथ गैर-विशिष्ट बंधन के लिए प्रवण होते हैं, जिससे लिपोसोम एकत्रीकरण होता है और जल्दी से शरीर से बाहर निकल जाता है (जीवित रूप से धनायनित लिपोसोम का आधा जीवन केवल 15 मिनट है)।

इस समस्या को हल करने के लिए, शोधकर्ताओं ने एक नए प्रकार का लिपिड पदार्थ विकसित किया है जिसे आयनाइज़ेबल लिपिड कहा जाता है। आयनीकृत लिपिड संरचना में धनायनित लिपिड के बहुत समान होते हैं। उदाहरण के तौर पर सामान्य धनायनित लिपिड डीओटीएपी और आयनीकरणीय लिपिड डीओडीएपी को लेते हुए, अंतर यह है कि डीओटीएपी एक धनात्मक आवेश वाला चतुर्धातुक अमोनियम नमक है, जबकि डीओडीएपी एक तृतीयक अमीन संरचना है। तृतीयक अमीन संरचना लिपिड के पीकेए को 6-7 के बीच रख सकती है। जब पीएच पीकेए (अम्लीय परिस्थितियों में) से कम होता है, तो आयनीकरण योग्य लिपिड सकारात्मक रूप से चार्ज होते हैं।

जब पीएच पीकेए (तटस्थ परिस्थितियों में) के करीब होता है, तो आयनीकरण योग्य लिपिड तटस्थ होते हैं। यह डिज़ाइन धनायनित लिपोसोम्स द्वारा सामना की जाने वाली समस्या को चतुराई से हल कर सकता है: चूंकि रक्त परिसंचरण में पीएच तटस्थ के करीब है, आयनीकरण योग्य लिपिड भी तटस्थ हैं, और उनके और प्लाज्मा प्रोटीन या रक्त कोशिकाओं के बीच गैर-{1}विशिष्ट बंधन काफी कम हो जाता है, जिससे आधा जीवन बढ़ जाता है। इसके अलावा, जब आयनीकृत लिपिड एलएनपी कोशिकाओं द्वारा ग्रहण किया जाता है और लाइसोसोम में प्रवेश करता है, तो लिपिड आयनीकृत होते हैं और लाइसोसोमल वातावरण में pH 5{5}}6 के साथ सकारात्मक रूप से चार्ज होते हैं। सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए लिपिड आसानी से एंडोसोम-लाइसोसोम झिल्ली के साथ जुड़ जाते हैं, जिससे लिपोसोम साइटोप्लाज्म से बच जाते हैं, अलग हो जाते हैं और न्यूक्लिक एसिड छोड़ते हैं, जिससे उनका प्रभाव पड़ता है। संक्षेप में, एलएनपी वाहक प्रणाली को डिजाइन करने में कुशल जीन वितरण प्राप्त करने के लिए लिपिड संरचना, कण आकार, सतह चार्ज और स्थिरता को अनुकूलित करना शामिल है।

एलएनपी - पैकेज्ड जीन ड्रग्स के लिए एलसीएमएस बायोएनालिसिस रणनीति

एलएनपी-पैकेज्ड जीन दवाओं में मुख्य रूप से एलएनपी शेल और जीन दवा ही शामिल होती है। एलएनपी शेल में मुख्य रूप से लिपिड घटक होते हैं (धनायनिक/आयोनिजेबल लिपिड लगभग 30-50%, पीईजी लिपिड लगभग 2%, कोलेस्ट्रॉल लगभग 20-50%, सहायक फॉस्फोलिपिड लगभग 10-20% होते हैं), जबकि जीन दवाओं में मुख्य रूप से जीन अनुक्रम टुकड़े (डीएनए, एएसओ, सीआरएनए और एमआईआरएनए, आदि) होते हैं। एनएमपीए और एफडीए के नवीनतम नियमों के अनुसार [14-15], एलएनपी जैसी दवा वितरण प्रणाली दवाओं के आईएनडी अनुप्रयोग के लिए, सक्रिय घटक (जीन अनुक्रम) पर फार्माकोलॉजिकल और फार्माकोकाइनेटिक अध्ययन करने के अलावा, नए लिपिड घटकों के लिए सुरक्षा और फार्मास्युटिकल मूल्यांकन भी आवश्यक है जिनका उपयोग दवा वितरण प्रणाली में विपणन दवाओं में नहीं किया गया है, जैसे एलएनपी में विशेष संशोधनों के साथ धनायनित/आयोनिजेबल लिपिड और पीईजी लिपिड।

एलएनपी लिपिड का एलसीएमएस बायोएनालिसिस धनायनित/आयोनिजेबल लिपिड और पीईजी लिपिड पर केंद्रित है। उनके बीच संरचनात्मक अंतर के कारण, cationic/ionizable लिपिड आणविक भार आम तौर पर 1 kDa के भीतर होता है, जबकि PEG लिपिड आणविक भार संशोधन समूहों को ले जाने के बाद 2 ~ 5 kDa तक पहुंच सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उनके बीच क्रोमैटोग्राफिक प्रतिधारण और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री प्रतिक्रिया में बड़ा अंतर होता है। यह ध्यान में रखते हुए कि एलएनपी में cationic/ionizable लिपिड की सामग्री पीईजी लिपिड की तुलना में अधिक है, प्रतिक्रिया अंतर दोनों के प्रीट्रीटमेंट तरीकों (निष्कर्षण विलायक का चयन, कमजोर पड़ने वाले कारक का निर्धारण) को प्रभावी ढंग से एकीकृत करने में असमर्थता की ओर जाता है। इसके अलावा, पीईजी लिपिड की चरम स्थिति के आसपास कई हस्तक्षेप करने वाली चोटियों की उपस्थिति के कारण, प्रभावी पृथक्करण के लिए अक्सर एक लंबी तरल चरण पृथक्करण ढाल की आवश्यकता होती है, जो उच्च विश्लेषण दक्षता की गारंटी नहीं दे सकती है। इसलिए, हम बायोएनालिसिस में अलग से पीईजी लिपिड डिटेक्शन विधि स्थापित करते हैं। साथ ही, cationic/ionizable लिपिड और PEG लिपिड में भी उनके लिपिड घटकों के कारण विधि विकास में आम कठिनाइयाँ होती हैं, जैसे पानी में खराब घुलनशीलता, जैविक मैट्रिक्स में अस्थिरता, सीमा से अधिक पुनर्प्राप्ति के लिए प्रोटीन बंधन, उच्च हस्तक्षेप और PEG लिपिड के अवशेष, वास्तविक नमूना मैट्रिक्स में लिपिड की स्थिरता परिवर्तन और आंतरिक मानक चयन में कठिनाई।